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In der Molekularbiologie schauen wir uns Dinge an (eben die Moleküle), die von Auge und auch mit stärksten Mikroskopen nicht sichtbar sind. Das heißt, dass wir auf Methoden angewiesen, die uns diese Moleküle indirekt sichtbar machen: indem sie bspw. von anderen, leuchtenden Molekülen gebunden werden, oder quasi einen Schatten werfen, oder digitale Daten, die am Computer ein Bild ergeben. Ein zentrales Thema aller dieser Methoden ist ihre Empfindlichkeit, also wieviel Material gebraucht wird, um das zu „sehen“, was man sehen will.

In unserer Forschung beschäftigen wir uns mit vielen Aspekten rund um die RNA-Moleküle (ebenfalls in Herpesvirusinfektionen bspw. in einer Publikation von vor zwei Jahren). In jeder menschlichen Zelle gibt es zehntausende verschiedene RNA-Moleküle, insgesamt einige Hunderttausend. Sie wirken als temporäre Datenspeicher, übersetzen genetische Information, halten Dinge zusammen, oder aktivieren oder deaktivieren sich gegenseitig. Bei dieser Vielfalt braucht es natürlich auch eine gute und empfindliche Methode, um die RNA bspw. in menschlichen Zellen zu messen. Sowas gibt es, aber die Empfindlichkeit war bis vor kurzem noch nicht so, wie man sie gerne hätte: um RNA-Moleküle zu messen, mussten Zehntausende von Zellen in einen Topf geworfen werden. Diese Zellen sind aber nicht alle gleich! Die einen teilen sich gerade, die andere sind etwas gestresst, die dritten wurden vielleicht soeben von einem Virus infiziert. Wenn Zellen Früchte wären, entspräche das einem Smoothie. Auch lecker, aber wenn man einen großen Schluck nimmt, ist unklar, was da genau drin war.

 

Danny Nicholson from Southend on Sea, England [CC BY-SA 2.0]
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Umbrella_with_smoothie_(279980521).jpg

In den letzten Jahren etablierte sich mit der RNA-Einzelzellsequenzierung aber eine neue Technik, in der nicht Zehntausende von Zellen gemischt wurden, um die RNA im Gemisch zu messen, sondern die RNA-Moleküle in jeder einzelnen Zelle. Quasi ein Fruchtsalat, aus der man jedes Stück einzeln rauspicken und inspizieren kann. Diese Fruchtsalatmethode haben wir, auf Herpes-Simplex-Infektionen angewandt, für unsere neuste Publikation am Berliner Institut für Medizinische Systembiologie im Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin in der Helmholtz-Gemeinschaft verwendet.

Warum ist es wichtig, einzelne Zellen untersuchen zu können? Nehmen wir den Fall der Virusinfektion: die einen Zellen haben viel Virus abgekriegt, die anderen gar nichts, und es gibt auch ohne Infektion Unterschiede zwischen den Zellen, die die Infektion beeinflussen können. Auch wenn wir mit einem sehr einfachen System arbeiten (menschliche Hautzellen in der Plastikschale), haben wir bei einer mit Herpesvirus infizierten Kulturschale ein Spektrum von Zuständen. Mit der hergebrachten Smoothie-Methode, um RNA zu messen, gibt es einen Durchschnitt von allen Zellen in der Schale. Die Einzelzellsequenzierung hingegen untersucht jede Zelle in der Schale einzelnen. Wir können also viel genauer erkennen, was in den verschiedenen Zellen vor sich geht.

Die Einzelzellsequenzierung produziert eine enorme Menge Daten. In unserem Experiment haben wir ungefähr 12000 Zellen gemessen, und pro Zelle Messwerte für einige Tausend RNAs. Das bedeutet also eine Tabelle mit Millionen von Feldern! Richtig anschauen kann man diese Zahlenflut nicht mehr, d.h. wir sind auf Computerprogramme angewiesen, um die Daten anzuzeigen und zu interpretieren. Eine Methode ist es, die Zellen als bunte Punkte auf einer Fläche so anzuordnen, dass ähnliche Zellen benachbart sind. Hier bspw. sind Zellen ohne RNA vom Virus hellgrau, Zellen mit wenig Virus-RNA blau, und die dunkelroten haben dann am meisten davon:

Herpesviren haben genau wie Menschen Gene, wenn auch nur ungefähr 80 (beim Menschen sind es mehr als 20000). Diese werden bei einer Infektion nacheinander angeschaltet, und produzieren dann die entsprechende RNA. Das ist schon länger bekannt, und es ist auch bekannt, welche Gene ganz zu Beginn, und welche erst später in der Infektion angeschaltet werden. Aber wie gesagt, das wurde mit „Smoothie-Methoden“ ermittelt, und entsprechend ungenau. Mit der Einzelzellsequenzierung können wir dann beispielsweise die Reihenfolge, in der virale Gene angeschaltet werden, viel genauer bestimmen.

Was uns bei Virusinfektionen natürlich immer interessiert, ist, warum Zellen vom Virus komplett überrollt werden, oder resistent sein können. Das ist dann auch relevant für mögliche Behandlungen von Virusinfektionen. Schon das Bild oben zeigt, wie unterschiedlich diese Zellen sind. Um das noch in Zahlen zu fassen: 5 Stunden nach Zugabe des Virus zu den Zellen enthielten alle Zellen RNA vom Virus, aber auf einer Spannbreite von 0.1 bis 30%. Das ist viel unterschiedlicher, als es eine zufällige Verteilung der Anzahl Viren, die eine Zelle infizieren, erklären könnte. Es muss also noch andere Erklärungen geben, warum sich das Virus in einigen Zellen mehr und in anderen weniger breitmacht. Das kann untersucht werden, indem die Zustände der Zellen in eine zeitliche Abfolge gebracht wird. Als einfaches Beispiel:

Zustand A -> Zustand mit starker Infektion
Zustand B -> Zustand mit schwacher Infektion

Wir konnten tatsächlich solche Zustände A und B unterscheiden. Der Zustand B war dadurch gekennzeichnet, dass in diesen Zellen, warum auch immer, ein zellulärer Faktor, nämlich NRF2, aktiv war. Wir fanden also in diesem Datenwust, dass hohe NRF2-Aktivität eventuell die Infektion hemmt. Was wichtig ist, um diese Art der Forschung einzuschätzen: wir suchten „explorativ“ nach Prozessen, die einen Einfluss auf die Infektion haben können, aber bisher nicht in Verbindung damit gebracht wurden. Ohne dabei aber eine Vorstellung zu haben, welche von den Zehntausenden Prozessen in menschlichen Zellen das sein könnten! Dieser „unbiased approach“ ist ein wichtiges Merkmal der modernen Systembiologie, wie sie in unserem Institut angewandt wird.

NRF2 is schon in vielen Aspekten wie Krebs oder Nierenkrankheiten erforscht, und entsprechend gibt es auch schon einige Stoffe, die NRF2 aktivieren. Wir haben zwei dieser Stoffe getestet, ob sie einen Effekt auf die Herpesvirus-Infektion hatten. Einerseits testeten wir Bardoxolone methyl, ein Stoff, der zur Zeit in einer Phase-3-Studie in der Klinik bei Nierenkrankheiten getestet wird. Andererseits Sulforaphan, das bspw. in Broccoli erhalten ist*. Beide Stoffe konnten in der Tat die Infektion bremsen, womit wir die Hypothese, die sich aus der Interpretation der Daten am Computer ergeben hat, bestätigen konnten. Bedeutet das, das ein neues Herpesmedikament gefunden wurde? So einfach ist es natürlich nicht. Unsere Experimente haben wir in menschlichen Zellen in Zellkultur gemacht, und ob Bardoxolone oder Sulforaphane im Körper so wirkt wie in der Plastikschale, muss erst noch gezeigt werden – ganz abgesehen von Sicherheitsaspekten, die vor einer Anwendung beim Menschen geklärt werden müssen.

 

Zum Weiterlesen: Text auf der Website des Max-Delbrück-Centrums – https://www.mdc-berlin.de/de/news/press/herpesviren-bekaempfen

Originalpublikation: Single-cell RNA-sequencing of herpes simplex virus 1-infected cells connects NRF2 activation to an antiviral program – https://www.nature.com/articles/s41467-019-12894-z

 

 

* Die Aktivierung von NRF2 ist auch der Grund, warum Broccoli „antioxidative Wirkung“ zugeschrieben wird, da NRF2 ein „antioxidatives Programm“ anschaltet. Was das genau bedeutet, ist unklar, und benötigt noch viel Forschung. Zumindest hat es dem Sulforaphan eine eigene Website beschert: sulforaphan.org (ich habe die website weder im Detail durchgelesen noch kann ich beurteilen, inwieweit die Angaben dort zutreffen!)